Приказ Министерства здравоохранения Приднестровской Молдавской Республики
О введении в действие МУК МЗ ПМР 4.2.026-13 «Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах»
Не нуждается в государственной регистрации
в Министерстве юстиции Приднестровской Молдавской Республики.
В соответствии с Законом Приднестровской Молдавской Республики от 3 июня 2008 года № 481-З-IV «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (САЗ 08-22) с изменением и дополнениями, внесенными Законом Приднестровской Молдавской Республики от 6 августа 2009 года № 838-ЗИД-IV (САЗ 09-32), в целях дальнейшего совершенствования санитарно-противоэпидемического обеспечения населения Приднестровской Молдавской Республики, приказываю:
1. Ввести в действие на территории Приднестровской Молдавской Республики методические указания МУК МЗ ПМР 4.2.026-13 «Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах» (прилагаются).
2. Контроль за исполнением настоящего Приказа возложить на Главного врача ГУ «Республиканский центр гигиены и эпидемиологии» - Печул А.С.
3. Настоящий Приказ вступает в силу со дня официального опубликования.
Министр В. Гуменный
г. Тирасполь
20 марта 2013 г.
№ 137
Приложение к Приказу
Министерства здравоохранения
Приднестровской Молдавской Республики
от 20 марта 2013 года № 137
Методические указания
МУК МЗ ПМР 4.2.026 -13
«Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах»
1. Область применения
1. Настоящие методические указания (далее - МУК) разработаны в соответствии с Законом Приднестровской Молдавской Республики от 3 июня 2008 года № 481-З-IV «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (САЗ 08-22) с изменением и дополнениями, внесенными Законом Приднестровской Молдавской Республики от 6 августа 2009 года № 838-ЗИД- IV (САЗ 09-32), в целях дальнейшего совершенствования санитарно-эпидемиологического обеспечения населения Приднестровской Молдавской Республики.
2. МУК устанавливают экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах (далее - метод) по микробиологическим показателям безопасности для здоровья человека, проводимых в порядке производственного контроля, государственного санитарно-эпидемиологического надзора, а также при испытании пищевых продуктов в целях сертификации.
3. МУК предназначены для применения в бактериологических производственных, испытательных лабораториях и лабораториях учреждений Государственной санитарно - эпидемиологической службы Министерства здравоохранения Приднестровской Молдавской Республики (далее - Госсанэпидслужба) и позволяют проводить контроль на соответствие СанПиН МЗ и СЗ ПМР 2.3.2.1078-09 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», утвержденным Приказом Министерства Промышленности Приднестровской Молдавской Республики от 29 июня 2009 года № 338 (регистрационный № 5070 от 30 ноября 2009 года) (САЗ 09-49).
2. Сущность метода
4. МУК содержат описание ускоренного метода качественного и количественного обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах и других субстратах, основанного на подавлении антибиотиком дегидрогеназной активности тест - культур в жидкой питательной среде.
5. Дегидрогеназы - ферменты активируют процессы дыхания в живой клетке. Повреждение дегидрогеназ приводит к нарушению окислительно-восстановительных процессов и гибели клетки.
6. Высокая чувствительность этих ферментов к неблагоприятным воздействиям использована для выявления повреждающего действия антибиотика на различные тесткультуры. В методе используется способность клеток тест-культур восстанавливать метиленовый синий в анаэробных условиях. Если антибиотик оказывает цитотоксическое действие, клетки тест - культур лишаются такой возможности и метиленовый синий не восстанавливается. Метиленовый синий играет в этой системе одновременно роль акцептора водорода и индикатора, позволяющего судить о повреждающем действии антибиотиков на клеточные дегидрогеназы за определенный отрезок времени.
Данные сравнительного изучения экспресс-метода с общепринятым (диффузии в агар) свидетельствуют о высокой степени корреляции (коэффициент Р = 0,84 - 0,93 и значим с вероятностью 99,9 %).
7. Преимущество экспресс-метода заключается в возможности получения ответа через 4 - 5 часов, относительной простоте и значительной экономии питательной среды.
8. Методика может быть осуществлена как в качественном, так и в количественном варианте, при этом при подсчете концентрации выявленного загрязнения используется титрационный принцип, в определенной степени облегчающий постановку анализа в баклабораториях и позволяющий получить достоверные результаты без построения стандартной кривой или расчета по таблицам активности антибиотиков.
9. Лабораторный контроль, позволяющий выявить непосредственные источники загрязнения, принимать меры, снижающие контаминацию продуктов и, соответственно, риск для потребителей, целесообразно, главным образом, осуществлять в первичном звене получения животноводческой продукции: на молочно-товарных фермах, птицефабриках, в убойных и мясо-перерабатывающих цехах хозяйств, сельскохозяйственных предприятиях, получающих и перерабатывающих продовольственное сырье животного происхождения. Готовая животноводческая продукция также должна контролироваться путем периодического отбора на молочных заводах, мясокомбинатах, птицеперерабатывающих заводах.
10. Допустимое содержание антибиотиков в продуктах не должно превышать для тетрациклинов 0,01 ЕД, пенициллина 0,01 ЕД, для стрептомицина 0,5 ЕД на 1 г (см³) продукта.
11. Метод состоит из нескольких этапов:
а) подготовка проб к исследованию при качественном и количественном определении;
б) получение и хранение взвеси клеток тест - культур;
в) определение «рабочей дозы» тест - культур;
г) определение концентрации антибиотиков и расчет активности;
д) определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе;
е) качественное определение антибиотиков.
3. Подготовка проб к исследованию при качественном определении
12. Молоко и сливки жидкие (в сыром или пастеризованном виде): сырое молоко желательно подвергать исследованию в день отбора, как можно быстрее после получения (отбор на фермах); до начала анализа сохранять в холодильнике при температуре (4 ± 1) °С. Пробу в объеме не менее 10 см³ переносят в пробирку.
13. Сухие молочные продукты (сухое молоко, сухие сливки, сухие детские молочные продукты, изготовленные на основе коровьего молока): непосредственно перед исследованием продукты подвергаются восстановлению в кипяченой воде при температуре не выше (45 ± 1) °С в соответствии с указаниями на этикетке. Образцы тщательно перемешивают, они не должны содержать нерастворенных частиц или комков. Из восстановленного продукта отбирают пробы для анализа в объеме не менее 10 см³.
14. Яйца, меланж: яйца, предназначенные для исследования, предварительно прогревают на водяной бане при температуре (65 ± 1) °С в течение 10 -15 минут до коагуляции белка, затем полностью смешивают содержимое яйца, от которого отбирают пробы для анализа в объеме не менее 10 см³.
15. Мясо и субпродукты (печень, почки, язык и другие) скота и птицы, предназначенные для исследования, измельчают при помощи мясорубки или гомогенизатора, помещают полученный фарш в чашку Петри и дают стечь тканевому соку. Тканевой сок в объеме не менее 10 см³ переносят в пробирку.
16. Термическая обработка проб пищевых продуктов.
Перед проведением исследования пробирки с отобранными пробами помещают в водяную баню с температурой (60 ± 1) °С. Параллельно с испытуемыми образцами в водяную баню помещают пробирки с аналогичным продуктом и термометром. Время прогревания - 30 минут (отмечают от момента достижения температуры внутри пробирки).
4. Подготовка проб к исследованию при количественном определении
17. Молоко, молочные продукты и яйца.
Для определения концентрации антибиотика в молоке, жидких молочных продуктах (кроме кисломолочных), яйцах, пробы, подготовленные к исследованию в количестве 10 см³ или 10 г (смешанного содержимого каждого яйца) вносят в колбы емкостью 50 см³ и добавляют равное количество (10 см³) буферного раствора соответственно определяемому антибиотику: при определении тетрациклина - цитратно-солянокислый буфер № 2; стрептомицина или пенициллина - фосфатный буфер № 4 и № 1 соответственно. Таким образом, получают пробы для исследования, разведенные в 2 раза.
18. Мясо и мясные продукты.
Навески по 10 г мышечной ткани, почки, печени, легкого или другого субпродукта, вырезанные из средней части образца, измельчают ножницами или микроразмельчителем тканей с последующим растиранием в ступке со стерильным кварцевым песком. Затем в ступку добавляют 10 см³ соответствующего буфера, тщательно перемешивают и переносят в центрифужные пробирки. Экстракцию антибиотика проводят в течение 90 минут в термостате при температуре (37 ± 1) °С. Затем пробы прогревают на водяной бане при температуре (65 ± 1) °С 30 минут и центрифугируют при 3000 оборотов/минуту в течение 20 минут. Из надосадочной жидкости, являющейся первым разведением 1 : 2, берут 1 см³ и прибавляют 1 см³ соответствующего буфера, получают второе разведение 1 : 4 и так далее делают последовательные двукратные разведения. Концентрацию антибиотика определяют в надосадочной жидкости, полученной от каждого образца мяса и мясных продуктов.
5. Получение и хранение взвеси клеток тест - культур
19. Тест - культурами служат вегетативные формы спорообразующих и неспорообразующих культур: Вас. subtilis, вар. 6633; Вас. subtilis, вар. L2; Вас. mycoides 537; Micrococcus luteum ATCC 9341, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам.
20. Для определения пенициллина и стрептомицина предпочтительно пользоваться спорообразующими тест - культурами: Вас. subtilis, вар. 6633; Вас. mycoides 537 u Micrococcus luteum ATCC 9341; для тетрациклина - Вас. subtilis, вар. L2.
Музейные штаммы вегетативных форм тест - культур хранят в столбике полужидкого (0,4 %-ного) питательного агара.
21. Вначале тест - культуру рассевают на чашки с 2 %-ным мясо - пептонным агаром для получения отдельных колоний. Чашки ставят в термостат при температуре (37 ± 1) °С на 20 ± 3 часа. После чего мелкие колонии отсевают в пробирки с 2 %-ным мясо-пептонным скошенным агаром и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 20 ± 3 часа.
22. Микробную взвесь готовят путем смыва физиологическим раствором суточной культуры со скошенного агара. Важно, чтобы смыв культур был гомогенным и не содержал комочков. Полученную взвесь хранят в холодильнике при температуре (4 ± 1) °С не более 7 дней.
6. Определение «рабочей дозы» тест - культур
23. Поскольку количество жизнеспособных клеток тест - культуры от смыва к смыву варьирует, предварительно необходимо определить «рабочую дозу» тест - культуры, то есть наибольшее разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в определенное время в термостате при температуре (37 ± 1) °С. Следует учитывать, что время обесцвечивания метиленового синего обратно пропорционально количеству клеток в смыве.
24. Для постановки реакции выбрано время обесцвечивания, равное 1 часу. Это время, будучи величиной постоянной, выявляет в суспензиях различной плотности одну и ту же клеточную нагрузку для каждой тест - культуры в отдельности. «Рабочую дозу» тест - культур устанавливают по дегидрогеназной активности клеток.
25. Методика определения «рабочей дозы» тест - культуры.
Полученную взвесь тест - культур титруют путем последовательных двукратных разведений в объеме 1 см³ питательного бульона. Пробирки с тест - культурой встряхивают и помещают в термостат при температуре (37 ± 1) °С на 3 часа. Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку вносят по 2 см³ растопленного и охлажденного до температуры (45 ± 1) °С 1 %-ного питательного агара с метиленовым синим и глюкозой. Оба ингредиента асептично вносят в растопленный 1 %-ный питательный агар из расчета: на 100 см³ среды 0,4 см³ 0,5 %-ного водного раствора метиленового синего и 1 см³ 40 %-ного раствора глюкозы. Пробирки встряхивают и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение от 1 до 2 часов, после чего учитывают результат (Таблица № 1 настоящих МУК). Дыхательные ферменты бактериальных клеток тест - культур восстанавливают метиленовый синий в анаэробных условиях, и содержимое пробирок, имеющее синий цвет, обесцвечивается. Разведение тест - культуры в последней пробирке с обесцвеченным метиленовым синим (+) принимают за «рабочую дозу». Функциональная активность дегидрогеназ тест - культур стабилизируется через сутки после получения смыва, который хранится в холодильнике в течение 1 недели. Поэтому «рабочую дозу» первый раз определяют через сутки, а затем - через 3 дня.
7. Количественное определение концентрации антибиотиков и расчет активности
26. При определении концентрации антибиотика в пищевых продуктах параллельно ставят контрольный ряд с известным содержанием антибиотика в пробирках. Для этого навеску стандарта антибиотика (1 мг) растворяют в 1 см³ соответствующего буфера, получая, таким образом, основной раствор стандарта 1000 мкг/см³. Затем основной раствор десятикратно разводят до получения 100 мкг/см³ и 10 мкг/см³. Далее концентрации, с которых начинается титрование стандарта в контрольном ряду (2,0; 1,0; 0,5 мкг/см³ и так далее), разводят соответствующими буферными растворами.
Таблица № 1
Определение «рабочей дозы» тест – культур
|
Тест - культуры
|
Время,
часы
|
Учет интенсивности клеточного дыхания
|
|
Разведения тест - культур
|
|
1:2
|
1:4
|
1:8
|
1:16
|
1:32
|
1:64
|
1:128
|
1:256
|
1:512
|
1:1024
|
|
B.subtilis вар. 6633
|
1
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
|
B.subtilis вар.L2
|
1
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
|
B.mycoides 537
|
1
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
|
Micrococcus luteum АТСС 9341
|
1
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
-
|
Примечание:
Обозначения: знак плюс (+) - полное обесцвечивание метиленового синего, знак минус (-) - отсутствие обесцвечивания.
27. Максимальное разведение тест-культур, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего и выявленное через 1 час инкубации в термостате при 37 °С, принимают за «рабочую дозу».
В среднем, «рабочая доза» определяется у следующих тест - культур:
а) Вас.subtilis, вар.6633 в разведении 1:256
б) Вас.subtilis, вар.L2 в разведении 1:512
в) Вас.mycoides 537 в разведении 1:128
г) Micrococcus luteum AТCC 9341 в разведении 1:64
28. Титрование стандарта антибиотика и испытуемых образцов проводят путем двукратных разведений в объеме 0,5 см³ мясо - пептонного бульона. Последняя пробирка в контрольном ряду не содержит антибиотик и служит контролем дегидрогеназной активности клеток тест - культуры.
29. После этого во все пробирки вносят 0,5 см³ взвеси, содержащей двойную «рабочую дозу» тест - культуры, то есть предпоследнее разведение тест - культуры, вызывающее обесцвечивание метиленового синего через 1 час. В результате микробная нагрузка в пробирках уменьшается вдвое и соответствует «рабочей дозе» тест - культуры.
30. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре (37 ± 1) °С на 3-часовую экспозицию тест - культуры с антибиотиком. Затем в каждую пробирку добавляют по 2 см³ 1 %-ного мясо - пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок вновь смешивают и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в термостате.
31. Если в исследуемом объекте содержится антибиотик, то он блокирует дыхательные ферменты бактериальных клеток тест - культур и вызывает их гибель. В этих пробирках метиленовый синий не обесцвечивается (синий).
32. О степени активности антибиотика судят по его минимальной концентрации, которая вызывает полное подавление дегидрогеназ клеток тест - культур через 1 или 2 часа инкубации в термостате при температуре (37 ± 1) °С по сравнению с контролем.
8. Определение концентрации бензилпенициллина, стрептомицина и тетрациклина
33. Приготовление стандарта бензилпенициллина.
Во флакон, содержащий 500000 ЕД натриевой соли бензилпенициллина товарного препарата для инъекций, добавляют 10 см³ 0,066 М фосфатного буфера pH 7,0. Концентрация исходного раствора пенициллина составляет 50000 ЕД/см³. Далее получают 5000 ЕД/см³, разводя этот раствор в 10 раз. К 1 см³ этого раствора прибавляют 4 см³ 0,066 М фосфатного буфера, pH 7,0. Получают основной раствор пенициллина - 1000 ЕД/ см³. Затем разводят десятикратно 0,066 М фосфатным буфером, pH 7,0 до 100 и 10 ЕД/см³. После этого 0,5 см³ последнего разведения, то есть 5 ЕД/см³ добавляют в 1-ю пробирку с заранее разлитым по 0,5 см³ мясо - пептонным бульоном. Получают разведение пенициллина в 1-й пробирке - 2,5 ЕД/см³. Далее делают двукратные разведения антибиотика в 0,5 см³ мясо - пептонного бульона. Во все пробирки добавляют 0,5 см³ взвеси, содержащей двойную «рабочую дозу» тест - культуры. В результате микробная нагрузка во всех пробирках уменьшается вдвое и соответствует «рабочей дозе» тест-культуры, при этом концентрация пенициллина в 1-й пробирке уменьшается еще в 2 раза и соответствует 1,25 ЕД/см³. Таким образом, получают разведения пенициллина:
а) в 1-й пробирке 1,25 ЕД;
б) в 2-й пробирке 0,62 ЕД;
в) в 3-й пробирке 0,31 ЕД;
г) в 4-й пробирке 0,15 ЕД;
д) в 5-й пробирке 0,07 ЕД;
е) в 6-й пробирке 0,035 ЕД;
ж) в 7-й пробирке 0,017 ЕД;
з) в 8-й пробирке 0,008 ЕД;
и) в 9-й пробирке 0,004 ЕД.
Последняя 10-я пробирка не содержит антибиотик и служит контролем дегидрогеназной активности тест - культуры (Таблица № 2 настоящих МУК).
34. Приготовление стандарта стрептомицина.
Во флакон, содержащий 500000 ЕД стрептомицина сульфата товарного препарата для инъекций, добавляют 10 см³ 0,066 М фосфатного буфера, pH 6,0-6,2. Концентрация исходного раствора стрептомицина составляет 50000 ЕД/ см³. Далее исходный раствор разводят в 10 раз 0,066 М фосфатным буфером, pH 7,8 - 8,0. Получают раствор 5000 ЕД/см³.
Последующие разведения готовят на 0,066 М фосфатном буфере, pH 7,8 - 8,0, аналогично схеме к бензилпенициллину, описанной в пункте 33 настоящих МУК.
35. Приготовление стандарта тетрациклина.
Для приготовления исходных растворов антибиотиков могут быть использованы лекарственные препараты антибиотиков или стандарты препаратов с известной активностью. В первичном растворе каждого антибиотика учитывают его активность в 1 мг (при использовании стандарта препарата) или содержание активного вещества в лекарственной форме (например, 100000 ЕД во флаконе). Основную концентрацию 1000 ЕД/см³ или 1000 мкг/см³ готовят, разводя препарат во флаконе, содержащем 100000 ЕД тетрациклина, в 100 раз.
Таблица № 2
Концентрация стандарта бензилпенициллина
|
Время обесцвечивания
метиленового синего, часы
|
Учет интенсивности клеточного дыхания Разведение антибиотика в ЕД/см³
|
Контроль
тест - культуры
|
|
1,25
|
0,62
|
0,31
|
0,15
|
0,07
|
0,035
|
0,015
|
0,007
|
0,0035
|
к
|
|
1
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
|
2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
Примечание:
Обозначения: (+) - полное обесцвечивание метиленового синего, (+-) - частичное обесцвечивание метиленового синего, (-) - отсутствие обесцвечивания.
36. При активности стандарта тетрациклина 850 мкг/см³ в 10 мг навески содержится 8500 мкг антибиотика.
37. Для получения первого разведения основного раствора стандарта антибиотика в 1000 мкг устанавливают необходимый объем растворителя: 850 х 10 = 8500 : 1000 = 8,5 см³. Таким образом, навеску тетрациклина 10 мг растворяют в 8,5 см³ 0,01 Н HCI и получают концентрацию основного раствора 1000 мкг/см³. Приготовленный основной раствор может храниться в холодильнике в течение 7 дней.
38. Далее основной раствор 1000 мкг/см³ разводят десятикратно цитратно-солянокислым буфером, pH 6,0 - 6,2, до 100 и 10 мкг/см³. Все последующие разведения, готовят также на цитратно-солянокислом буфере, pH 6,0 - 6,2, и проводят расчеты активности стандарта тетрациклина аналогично схеме расчета по пенициллину и стрептомицину.
9. Определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе
39. Параллельно ставят второй ряд с двукратными разведениями испытуемого субстрата в пробирках с заранее разлитым мясо - пептонным бульоном в объеме 0,5 см³. Во все пробирки этого ряда также вносят 0,5 см³ взвеси, содержащей двойную «рабочую дозу» тест - культуры (то есть предпоследнее разведение тест - культуры, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего через 1 час инкубации в термостате). В результате микробная нагрузка уменьшается вдвое и соответствует «рабочей дозе» тест - культуры.
40. Таким образом, 1-я пробирка каждого ряда, контрольного и испытуемого, начинается с разведения 1 : 4.
41. Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест - культуры.
42. Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 3-часовую экспозицию тест - культуры с антибиотиком. Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку добавляют по 2 см³ 1 %-ного мясо - пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 1) °С.
43. Учет результатов производят по тесту подавления антибиотиком дегидрогеназной активности тест - культуры через 1 или 2 часа инкубации в термостате (Таблица № 3 настоящих МУК).
44. Концентрацию антибиотика в исследуемом субстрате с неизвестным его количеством вычисляют путем умножения последнего разведения субстрата, подавляющего дегидрогеназную активность тест - культуры (Таблица № 3 настоящих МУК), на минимальную концентрацию антибиотика контрольного ряда стандарта, вызывающего тот же эффект (Таблица № 2 настоящих МУК).
45. В соответствии с Таблицей № 2 настоящих МУК, последнее разведение стандарта бензилпенициллина, которое вызывает полное подавление активности дыхательных ферментов тест - культуры, по сравнению с контролем, только через 2 часа инкубации в термостате и составляет 0,07 ЕД/см³. Через 1 час инкубации антибиотик вызывает лишь частичное подавление дегидрогеназной активности клеток.
46. Таким образом, концентрация пенициллина, вызывающая полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культуры, соответствует 0,07 ЕД/см³ через 2 часа инкубации в термостате при температуре (37 ± 1) °С, аналогично Таблице № 3 настоящих МУК.
Таблица № 3
Концентрация бензилпенициллина в испытуемом субстрате
|
Время обесцвечивания
метиленового синего, часы
|
Учет интенсивности клеточного дыхания
|
Контроль
тест-культуры
|
|
Разведения испытуемого субстрата или образца
|
|
1 : 4
|
1 : 8
|
1 : 16
|
1 : 32
|
1 : 64
|
1 : 128
|
1 : 256
|
1 : 512
|
1 : 1024
|
к
|
|
1
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
|
2
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
47. Учесть результат в данном опыте возможно только через 2 часа инкубации по полному подавлению дегидрогеназной активности клеток тест-культуры, которое наблюдается в разведении 1 : 8, так как через 1 час инкубации испытуемый субстрат вызывает лишь частичное подавление активности дыхательных ферментов тест-культуры по сравнению с контролем (Таблица № 3 настоящих МУК).
48. Содержание пенициллина в исследуемом субстрате вычисляют, умножив последнее разведение субстрата, подавляющее дегидрогеназную активность клеток тест-культуры, на минимальную концентрацию антибиотика контрольного ряда стандарта, вызывающего тот же эффект, т.е. 0,07 х 8 = 0,56 ЕД/см³. Таким образом, в испытуемом субстрате содержится 0,56 ЕД/см³ пенициллина.
10. Качественное определение антибиотиков
49. Качественное определение антибиотиков в пищевых продуктах можно проводить по методике, описанной в разделе 7 настоящих МУК.
50. Проведение анализа:
а) подготовленные к исследованию испытуемые пробы в объеме 0,5 см³ вносят в пробирки с таким же (0,5 см³) количеством мясо-пептонного бульона и тщательно перемешивают. Во все пробирки добавляют 0,5 см³ взвеси, содержащей двойную «рабочую дозу» тест - культуры;
б) последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест - культуры;
в) пробирки встряхивают и помещают в термостат на 3-часовую экспозицию тест - культуры с испытуемым субстратом;
г) после этого в каждую пробирку вносят по 2 см³ растопленного и охлажденного до (45 ± 1) °С мясо-пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок смешивают и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение от 1 до 2 часов.
51. Учет результатов:
а) при отсутствии в испытуемых образцах антибиотика дыхательные ферменты бактериальных клеток тест - культур не нарушаются и восстанавливают (то есть обесцвечивают) в анаэробных условиях метиленовый синий;
б) в контрольной пробирке, где нет испытуемого образца, также происходит обесцвечивание в течение от 1 до 2 часов наблюдения в термостате при температуре (37 ± 1) °С (контроль ферментативной активности бактериальных клеток тест - культуры);
в) при наличии антибиотика в испытуемом образце дыхательные ферменты бактериальных клеток блокируются, метиленовый синий не восстанавливается и цвет содержимого пробирок не изменяется, остается синим;
г) параллельно в качестве второго контроля можно использовать субстраты, содержащие определенную концентрацию антибиотика.
11. Растворы, реактивы, применяемые для разведения стандартов антибиотиков и испытуемых образцов
52. Бензилпенициллин.
Основной раствор стандарта, рабочие разведения стандарта и испытуемый раствор готовят на буфере № 1 - 0,066 М фосфатный (pH 6,8 - 7,0).
Рецепт:
а) калия фосфат однозамещенный 3,63 г;
б) натрия фосфат двузамещенный 7,13 г;
в) вода дистиллированная 1000 см³.
53. Стрептомицин сульфат.
Основной раствор стандарта готовят на буфере № 3 - 0,066 М фосфатный (pH 6,0 - 6,2).
Рецепт:
а) калия фосфат однозамещенный 7,72 г;
б) натрия фосфат двузамещенный 1,78 г;
в) вода дистиллированная 1000 см³.
54. Рабочие разведения стандарта и экстракцию испытуемых образцов готовят на буфере № 4 - 0,066 М фосфатный (pH 7,8 - 8,0).
Рецепт:
а) калия фосфат однозамещенный 0,68 г;
б) натрия фосфат двузамещенный 10,99 г;
в) вода дистиллированная 1000 см³.
55. Тетрациклины.
Основной раствор стандарта растворяют в 0,01 ммоль/л соляной кислоте (HCI).
56. Рабочие разведения стандарта и экстракцию испытуемых образцов готовят на буфере № 2 - цитратно-солянокислый (pH 5,8 - 6,0).
Рецепт:
а) натрия цитрат трехзамещенный 20,6 г;
б) соляная кислота концентрированная 1,81 см³;
в) вода дистиллированная 1000 см³.
57. Мясо - пептонный бульон (выпускается в сухом виде и готовится согласно прилагаемой прописи на этикетке).
58. Мясо - пептонный агар (выпускается в сухом виде и готовится согласно прилагаемой прописи на этикетке).
59. 0,5 %-ный водный раствор метиленового синего.
60. 40 %-ный коммерческий раствор глюкозы.